摘要
植物甾醇(PS)已被證明可以調節膽固醇代謝，緩解高脂血癥(HLP)，但其機制尚不清楚。本文研究了PS調節高脂飲食(HFD)小鼠膽固醇代謝的機制。結果表明，PS處理降低了HFD小鼠血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的積累，同時提高了血清中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的水平。與HFD小鼠相比，PS不僅提高了肝臟的抗氧化活性，還調節了膽固醇代謝相關酶和受體的mRNA表達水平。抗生素(Abx)干預消除了PS的降血脂作用，糞菌移植(FMT)干預恢復了PS的降血脂作用。16S rRNA測序分析結果表明，PS可調節小鼠腸道菌群。PS降低了HFD小鼠腸道中乳桿菌(Lactobacillus)和其他產膽鹽水解酶(BSH-)的微生物群的相對豐度，這些菌群可能與膽固醇代謝有關。結果部分解釋了PS調節膽固醇代謝的機制。
文章信息
英文題目：：Phytosterols Alleviate Hyperlipidemia by Regulating Gut Microbiota and Cholesterol Metabolism in Mice
中文題目：植物甾醇通過調節小鼠腸道菌群和膽固醇代謝緩解高脂血癥
期刊名（SCI）：Oxidative Medicine and Cellular Longevity
影響因子（IF）：7.31
作者：潘忠超（廣東蔚萊生物科技有限公司總監）
試驗設計
試驗結果
1.植物甾醇減少小鼠肝臟脂肪沉積，改善肝臟健康
為了確定PS是否改善糖脂代謝，作者測定了小鼠血清中TG、TC、LDL-C和HDL-C的濃度，這些被認為是嚴重高脂血癥(HLP)的臨床生物標志物。HFD小鼠TG、TC、LDL-C濃度顯著升高，HDL-C濃度降低。與預期一致，PS處理后TG、TC和LDL-C濃度顯著降低，HDL-C濃度升高(圖2(b)-2(e))。為了探究PS是否調節小鼠的糖耐量，我們在口服葡萄糖3 h的過程中，每隔30 min測量一次血糖濃度。血糖譜和OGTT曲線下面積(AUC)顯示，HFD小鼠葡萄糖AUC增加，糖耐量受損，而HFD+PS小鼠的糖耐量較HFD小鼠明顯改善(圖2 (f)和2 (g)。
圖1. PS改善小鼠糖脂代謝紊亂。(a)各組肝組織切片代表性H&E染色。比例尺：200 μm。(b-e)血清TC、TG、LDL-C、HDL-C濃度(每組n = 5)。(f, g) ND、HFD、HFD+PS小鼠禁食12 h后給予2.0 g/kg葡萄糖的口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)結果及3組小鼠曲線下面積(AUC)分析(每組n = 4)。數據以均值±SD表示。與ND組相比，#P < 0.05，##P < 0.01和###P < 0.001；與HFD組相比，*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。
2.植物甾醇提高小鼠肝臟抗氧化活性
作者檢測了肝臟中氧化應激相關指標的mRNA水平。與ND小鼠相比，HFD顯著降低血紅素加氧酶1 (HO-1)的mRNA水平；與HFD組小鼠相比，PS顯著提高了Kelch樣ECH關聯蛋白1 (Keap1)、核因子E2相關因子2 (Nrf2)、HO-1、NAD(P)H醌脫氫酶1 (NQO1)、谷氨酸-半胱氨酸連接酶修飾亞基(GCLM)和谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)的mRNA水平(圖3 (a)~3 (f))。這些結果表明，PS不僅不會引起肝細胞損傷，而且顯著提高了對HFD誘導的氧化應激的抵抗能力。
這些結果表明，HFD顯著增加了小鼠血清TG、TC和LDL-C的濃度，降低了HDL-C，導致HLP，并導致糖耐量受損。PS治療逆轉了這些變化，改善了HLP和葡萄糖耐量。
圖2. PS提高了HFD小鼠肝臟抗氧化活性。(a~f)肝臟抗氧化基因Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLM、GCLC的mRNA相對表達量(每組n = 3)。數據以均值±SD表示。與ND組相比，#P < 0.05，##P < 0.01和###P < 0.001；與HFD組相比，*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。
3.植物甾醇調節膽固醇代謝相關酶和受體的mRNA表達
為了探討PS改善HLP的作用機制，作者首先檢測了膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)、固醇12α羥化酶(CYP8B1)、氧固醇7α-羥化酶(CYP7B1)和甾醇27羥化酶(CYP27A1)以及與膽固醇代謝相關的膽汁酸(BA)合成限速酶的mRNA水平。結果顯示，與ND小鼠相比，HFD小鼠CYP7A1和CYP8B1的表達明顯升高，CYP27A1和CYP7B1的表達也呈增加趨勢。PS干預導致HFD小鼠CYP8B1的mRNA相對表達量顯著降低，CYP7A1呈下降趨勢。在HFD+PS小鼠中，CYP7B1顯著上調，CYP27A1有升高的趨勢(圖4 (a)-4 (d))。
接下來，本研究還分析了肝臟中膽固醇代謝相關受體的mRNA相對表達量。結果顯示，HFD引起小鼠成纖維細胞生長因子受體4 (FGFR4)、Takeda G蛋白偶聯受體5 (TGR5)、法尼醇X受體(FXR) mRNA相對表達量升高，小異源二聚體蛋白(SHP) mRNA相對表達量降低。在HFD小鼠中，PS處理導致肝臟中TGR5和FGFR4的mRNA相對表達量顯著降低，FXR和SHP的mRNA水平顯著升高(圖4(e)-4(h))。
如上所述，PS抑制了肝臟膽固醇代謝的經典途徑，促進了替代途徑限速酶的表達。同時，PS抑制TGR5和FGFR4受體的表達，促進FXR和SHP受體的表達。
圖3. PS調節膽固醇代謝相關酶和受體的mRNA表達。(a~d)肝臟中CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1、CYP7B1等CYPs mRNA相對表達量。(e-h)肝臟中FGFR4、TGR5、SHP、FXR mRNA相對表達量。數據以均值±SD表示(每組n = 3)。與ND組相比，#P < 0.05，##P < 0.01和###P < 0.001；與HFD組相比，*P < 0.05，**P < 0.01。
4.植物甾醇緩解HLP的作用和腸道菌群變化相關
相關研究表明，腸道菌群及其代謝產物與膽固醇代謝密切相關。為了驗證PS的降血脂作用是否與腸道菌群有關，我們用Abx和FMT處理小鼠。結果顯示，與HFD+non-Abx+PS小鼠相比，HFD+Abx+PS小鼠的TG、TC、LDL-C顯著升高，HDL-C顯著降低(圖5 (a)-5 (d))。這意味著PS的降血脂作用被消除。此外，我們用PS處理FMT供體小鼠，并對Abx預處理的HFD小鼠給予FMT。與HFD+NS小鼠相比，HFD+FMT小鼠的TG、TC、LDL-C顯著降低，HDL-C顯著升高(圖5 (e)-5 (h))，HLP明顯改善。綜上所述，PS緩解HLP的作用與腸道菌群密切相關。
5.植物甾醇改變小鼠腸道菌群結構
首先，腸道菌群的主成分分析(PCA)結果顯示，ND組、HFD組和HFD+PS組的腸道微生物物種豐度存在不同的聚類(圖6 (a))。此外，層次聚類分析顯示PS處理改變了HFD小鼠的腸道菌群(圖6 (b))。屬水平的微生物群落組成分析顯示，與HFD小鼠相比，HFD+PS小鼠Allobaculum的相對豐度降低(圖6 (c))，乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)呈降低趨勢(圖6 (d)-6 (g))。值得注意的是，在種水平上，PS處理導致HFD小鼠陰道乳桿菌(Lactobacillus vaginalis)顯著減少(圖6 (h))。Pearson相關系數表明，總體而言，這些產生膽鹽水解酶(BSH-)的腸道微生物群的相對豐度與TG、TC、LDL-C和HDL-C的濃度以及細胞色素P450s (CYPs)的表達顯著相關(圖6 (i))。這些結果表明，PS的降血脂作用與改善小鼠腸道菌群結構有關。
圖5. PS改變了小鼠腸道菌群結構。(a)主成分分析(PCA)圖。(b)層次聚類分析。(c-g)腸道菌群在屬水平上的相對豐度，包括Allobaculum、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus) (每組n = 4)。(h)陰道乳桿菌(Lactobacillus vaginalis)的相對豐度。(i)腸道菌群與TC、TG、LDL-C、HDL-C、CYPs之間的Pearson相關系數。與ND組相比，#P < 0.05，##P < 0.01和###P < 0.001；與HFD組相比，*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。
結論
脂類的直接攝入或者體內合成對動物健康影響深遠，尤其脂肪肝已是部分動物的養殖后期死淘率的核心關鍵。植物甾醇因其在自然界中的廣泛存在及其強大的性能而被廣泛應用于醫學研究。多項研究表明，PS顯著降低血膽固醇濃度，在肥胖、HLP和糖尿病的治療中具有重要的臨床價值。
在本研究中，PS治療緩解了HFD小鼠的HLP，血清TG、TC和LDL-C水平顯著降低，HDL-C水平顯著升高。這些變化與已報道的PS降血脂作用一致。此外，我們還檢測了PS對肝臟抗氧化功能的影響。在我們的實驗中，PS提高了HFD小鼠Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLM和GCLC的mRNA相對表達量。本研究表明，PS處理不僅沒有引起HFD小鼠肝臟損傷，而且增強了肝臟的抗氧化作用，緩解了高脂對動物體的傷害。其機制與調節膽固醇代謝和腸道菌群結構有關。PS處理可調節腸道菌群的相對豐度，激活SHP和FXR，抑制FGFR4和TGR5，抑制BA合成的經典途徑(CYP7A1和CYP8B1)，激活BA合成的替代途徑(CYP27A1和CYP7B1)。本研究結果部分解釋了PS治療HLP的機制，可能與調節膽固醇代謝途徑和腸道菌群結構有關。
